菌落總數(shù)測定操作步驟及注意事項

一、測定標(biāo)準(zhǔn)

參考食品國家標(biāo)準(zhǔn)：GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》。

二、操作過程

1、前期準(zhǔn)備：

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，提前準(zhǔn)備好要用的平板計數(shù)瓊脂、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等，相應(yīng)的材料進(jìn)行滅菌處理（干熱滅菌或高壓滅菌）。

2、接收樣品：

收到樣品后，確認(rèn)樣品包裝是否完好，登記樣品信息，并將其保存在2~8℃冰箱中，然后在取樣時取出。

3、樣品處理：

按照作業(yè)指導(dǎo)書操作，仔細(xì)閱讀實驗要求。一般實驗室收到的是干粉樣品、固體樣品、或者液體樣品等。假如收到干粉樣品，那么首先需要將其配置成水溶液（即水化）。根據(jù)實驗要求及經(jīng)驗，進(jìn)行預(yù)判，預(yù)估稀釋液倍數(shù)，溶解即可。

4、實驗前準(zhǔn)備：

4.1實驗操作最好在超凈臺或者生物安全柜里操作，需要把超凈臺或者生物安全柜提前清理、消毒處理，確保實驗環(huán)境無菌。

4.2提前把要用到的平皿、試管、稀釋液等放到操作臺上紫外殺菌。

5、實驗操作：

5.1稀釋

將樣品從冰箱中取出達(dá)到室溫后開始取樣，在超潔凈臺或者生物安全柜下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進(jìn)行水化后吸入無菌瓶或袋中，再用剩余的稀釋液進(jìn)行洗滌并全部轉(zhuǎn)入無菌瓶或袋中。

洗滌轉(zhuǎn)移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進(jìn)行均質(zhì)混勻，一般作為原液立刻進(jìn)行接種；再取25ml到225ml稀釋液中均質(zhì)混勻，制成10-1梯度樣品勻液。

用1ml無菌吸管取1:10的樣液到9ml生理鹽水試管中，制成1:100的樣液，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標(biāo)記的無菌平皿中。

5.2傾注平板

將提前在水浴鍋里涼至46℃的平板計數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿，混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1ml稀釋液（不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。傾注過程一般左手拿平皿，右手拿瓊脂瓶，左手將平皿打開30°左右的縫隙，傾注瓊脂大約到平皿底的二分之一處，左三圈、右三圈輕輕混勻，然后放到臺面上。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置36±1℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h。

5.3觀察計數(shù)

24h觀察檢測結(jié)果有無異?，F(xiàn)象，是否有蔓延菌落出現(xiàn)。48h再按照GB 4789.2的要求進(jìn)行菌落計數(shù)。在對結(jié)果進(jìn)行分析后，選取檢測結(jié)果的平均值為最終數(shù)據(jù)。

三、注意事項

1、當(dāng)無法預(yù)判樣品菌落總數(shù)含量時，需要梯度稀釋，此步驟尤其關(guān)鍵，必須盡可能地減少誤差。

2、傾注用培養(yǎng)基應(yīng)在46℃水浴內(nèi)保溫，溫度過高會影響細(xì)菌生長，過低瓊脂易凝固，不能與菌液充分混勻。如無水浴條件，應(yīng)以皮膚感受較熱而不燙為宜。

3、傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚會影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應(yīng)將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。

4、傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

5、為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿時要盡可能放在中央部位，然后應(yīng)盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉(zhuǎn)混勻，可正反兩個方向旋轉(zhuǎn)，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不易過長，以防止細(xì)菌有所死亡或繁殖。

6、瓊脂培養(yǎng)基放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現(xiàn)平皿不凝固現(xiàn)象；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭干凈。

7、冷卻的過程不要著急，冷卻充分后再倒置放進(jìn)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，放置的時候要盡量避免放到風(fēng)機(jī)口處，每摞不要超過6個平皿。

8、檢測結(jié)束后所有的稀釋液樣品可放到冰箱里0-5℃冷藏，以備實驗出錯時再用。

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